Антинуклеарные антитела (АНА,ANA, антиядерные антитела, антинуклеарный фактор-АНФ)- метод НИФ на линии клеток HEp-2 с определением тип свечения. - показатель аутоиммунных заболеваний соединительной ткани. АНА представляет собой группу аутоантител к белкам и другим компонентам (включая ДНК), находящимся в ядрах клеток. Основные показания к применению: исключение диагноза - системная красная волчанка (считается, что АНА появляются в 90% случаев СКВ, иными словами, отрицательный результат с вероятностью около 90% исключает диагноз СКВ), дифференциальная диагностика системных коллагенозов (системная красная волчанка, склеродермия, узелковый периартериит, дерматомиозит), хронический активный гепатит.

К настоящему времени описано более 200 разновидностей АНА, направленных против нуклеиновых кислот, гистонов, белков ядерной мембраны, компонентов сплайсосомы, рибонуклеоротеинов, белков ядрышек и центромер. При этом они повреждают соединительную ткань, что и способствовало внедрению определения антинуклеарного фактора в качестве теста на системные заболевания соединительной ткани. Под термином «антинуклеарный фактор» понимают тест для выявления антинуклеарных антител с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции.

Одним из способов выявления антинуклеарного фактора в крови (антинуклеарных антител) является метод непрямой иммунофлюоресценции путем нанесения сыворотки пациента на клетки тканей перевиваемой линии человеческих клеток HEp-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека линии Hep-2, содержащие различные ядерные антигены), используя меченый конъюгат с человеческими антителами. В качестве субстратов могут применяться и другие человеческие клеточные линии, однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования именно линий Нер-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюоресценции. Метод обнаружения АНФ был разработан Tan в 1982, применившим в качестве субстрата человеческую перевиваемую эпителиоидную клеточную линию HEp-2. Это клеточная линия, полученная из аденокарциномы гортани человека, представляет собой крупные полиплоидные неороговевающие плоские эпителиоциты, образующие монослой на стекле. Сыворотку больного инкубируются с тканевым субстратом, при этом антинуклеарные антитела из сыворотки больного (если они присутствуют) связываются с соответствующими ядерным антигенами. Места связывания аутоантител детектируются с помощью античеловеческой антисыворотки, меченной флюоресцеином. Результаты реакции оцениваются микроскопией с помощью люминисцентного микроскопа и визуальной оценки характера свечения связавшихся антител. Среди преимуществ HEp-2 (при сравнении с криосрезами тканей животных) можно отметить высокую частоту деления клеток, позволяющую выявлять антитела к антигенам, экспрессирующимся только при делении клетки, и отсутствие клеточного матрикса ткани, затрудняющего визуализацию специфического свечения при сравнении с гистологическими срезами. При некоторых заболеваниях, например СКВ, системной склеродермии (системный склероз), некоторых инфекциях, иммунная система пациентов воспринимает ядра (белки ядер) клеток собственных тканей, как чужие, и продуцирует к ним антитела (антинуклеарные антитела - AHA). При этом они повреждают соединительную ткань, что и способствовало внедрению определения антинуклеарного фактора в качестве теста на системные заболевания соединительной ткани.

При интерпретации данных следует учитывать, что спектр AHA включает в себя большую группу аутоантител к ДНК, нуклеопротеидам, гистонам, ядерным рибонуклеопротеидам и другим компонентам ядра. Таким образом, тест направлен на обнаружение различных антител к компонентам ядра и цитоплазмы, которые впервые были обнаружены при СКВ. В дальнейшем диагностические критерии теста были расширены в связи с обнаружением данных антител и при других заболевания соединительной ткани.

В скрининговых тестах для определения суммарных АНА обычно используется набор следующих антигенов, являющихся основными маркерами аутоиммунных заболеваний соединительной ткани: SS-A (Ro), SS-B (La), BNP70, Sm, RNP/Sm, J01, центромере B.
Основные антигены, применяющиеся в современных наборах для выявления ядерных антител класса IgG представлены следующим набором:

1. SS-A (Ro) - ядерные рибонуклеопротеины, (полипептиды). Антитела на них обнаруживаются, чаще, при системной склеродермии (60 % случаев), синдроме Шегрена (до 70% случаев) и при СКВ (до 30% случаев). Считается, что если данные антитела обнаруживаются в крови у беременных, то это является показателем риска увеличения возникновения неонатального волчаночноподобного синдрома у новорожденного ребенка (неонатальный люпус-синдром). Данные антитела матери проходят через плаценту и вызывают поражение плода, приводящие к гемолитической анемии и тромбоцитопении. К тяжелым последствиям относят поражение проводящей системы сердца ребенка (вплоть до постоянной кардиостимуляции). Отмечено, что у женщин у которых во время беременности был выявлен значительный титр данных антител, без явных клинических признаков, в дальнейшем развивается какое либо аутоиммунное заболевание, включая СКВ.
2. SS-B (La) - ядерные белки. Антитела к ним выявляются до 60% случаев при синдроме Шегрена и в 15% случаев при СКВ.
3. Scl-70 - белок-фермент, участвующий в обмене нуклеиновых кислот (топоизомераза-1). Антитела на данный белок наиболее специфичны при системной склеродермии (до 70% случаев).
4. Двухцепочечная ДНК - нативная ДНК. Антитела к ДНК наиболее специфичны при СКВ (до 80% случаев) и практически не определяются при ревматоидном артрите и склеродермии.
5. RNP/Sm - Комплекс антигенов RNP/Sm состоит из U1-рибонуклеопротеидов: U1-68, U1-A, U1-C, U5, U6; а также из Sm-полипептидов: SmA | , SmB | B, SmD, SmE, SmF, SmG. Антитела, образующиеся к этим антигенам наиболее специфичны для смешанных заболеваний соединительной ткани - т.е. при наличии симптомов склеродермии, ревматоидного артрита, СКВ, полимиозита (около 95% случаев) и в меньшей степени для СКВ (до 30% случаев).
6. Jo-1 - фермент - синтетаза аминоацилтранспортной РНК. Аутоантитела к данному белку являются диагностически значимыми при миозите (полимиозит/дерматомиозит).
7. CENP-B (Центромера) - для выявления Антицетромерных антител (Anti-Centromer B), с целью диагностики CREST-синдрома (данный синдром представляет собой совокупность кальциноза кожи, синдрома Рейно, нарушения моторики пищевода, склеродактилии, телеангиэктазии). CREST-синдром относится к варианту системной склеродермии (системный склероз). Данные антитела у больных свидетельствуют о благоприятном течении системной склеродермии и говорят о небольшом поражении внутренних органов.
8. Hep-2 клетки - клетки эпителиальной карциномы гортани человека линии Hep-2, содержащие много различных ядерных антигенов, включая антиген SS-A (Ro) и антигены центромеры. Антитела к Hep-2 обнаруживаются у больных с полимиозитом и дерматомиозитом до 90% случаев.
9. Митохондрии (PDC) - PDC - пируватдегидрогеназный комплекс. Большая группа антимитохондриальных антител представляют собой аутоантитела, которые образовались на ферменты пируватдегидрогеназного комплекса, располагающегося в митохондриях клеток и участвующего в окислительном декарбоксилировании пирувата.

Часто АНА обнаруживаются при билиарном циррозе печени.

AHA обычно не проникают в живые клетки и поэтому безвредны. Но иногда они образуют комплексы антиген-антитело, которые вызывают повреждение ткани (как, например, при СКВ поражение почек). В связи с вовлечением в патологический процесс многих органов диагностическое значение определения AHA невелико и результаты анализа лишь частично подтверждают клинические данные.

Помимо ревматических заболеваний, АНА обнаруживаются и при хроническом активном гепатите до 50% случаев. Появление (низкие титры) возможно при воспалительных заболеваниях, онкологии и вирусных инфекциях.

• Сравнительная частота выявления антинуклеарных антител.
  

  Заболевание и состояние	Частота выявления, %
  СКВ	95-100
  Люпоидный гепатит (новое название - хронический аутоиммунный гепатит)	70 -80%
  Синдром Фелти (Felty. 1924 г.) - ревматоидный артрит + спленомегалия + нейтропения + лейкопения + лимфоаденопатия.	95-100
  Системная склеродермия	75-80
  Лекарственный волчаночныи синдром (гидралазин, прокаинамид, изониазид)	Около 50
  Синдром Шегрена (Аутоиммунное системное поражение соединительной ткани. Характеризуется вовлечением в патологический процесс желез внешней секреции, главным образом слюнных и слезных, и хроническим прогрессирующим течением).	40-75
  Клинически здоровые родственники пациента с СКВ	Около 25
  Дискоидная красная волчанка	15-50
  Хронический ювенильный артрит, ревматоидный артрит	15-30
  Узелковый периартериит	15-25
  Дерматомиозит и полимиозит	10-30
  Ревматизм	Около 5
  Синдром Рейно	15-20

Системные ревматические заболевания
Антинуклеарный фактор (АНФ) и тип свечения

Определение антинуклеарного фактора (АНФ) представляет собой основной метод выявления антинуклеарных антител, который позволяет выявить большинство разновидностей антинуклеарных антител, включая аутоантитела к нуклеиновым кислотам (дсДНК, осДНК, РНК), конформационным и нерастворимым антигенам. Результатом определения АНФ является факт присутствия аутоантител в диагностическом титре, конечный титр разведения сыворотки, отражающий аффинность и концентрацию аутоантител, а также тип свечения ядра клетки (тест 01.02.15.005) . Характеристики конкретной методики зависят, прежде всего, от выбора субстрата, который может варьировать от криосрезов (крысиных печени или почки) до культивируемых пролиферирующих клеточных линий (Hep2, Kb, HeLa), а также метода фиксации ткани, который может влиять на сохранность ряда ядерных антигенов АНА.

История разработки тестов для выявления антинуклеарных антител:

Начало ХХ века — «гиалиновые тельца» в цитоплазме лейкоцитов

1948 год Hargraves, Richmond, Morton — метод обнаружения LE-клеток invitro при длительной инкубации лейковзвеси больных СКВ

1951 год Lee, Michael, Vural — обнаружили сывороточный фактор, стимулирующий фагоцитоз ядер лимфоцитов лейкоцитами периферической крови

1957 год Holoborow, Weir, Johnsonиспользовали метод непрямой иммунофлюоресцнеции, разработанный Coons в 1950 для выявления АНФ на криосрезах печени человека

1961 год Beck — использовал ткани лабораторных животных

1982 год Tan — использовал перевиваемую клеточную линию человека HEp-2, этот тест стал золотым стандартом выявления АНА

1958 год Jones — обнаружил в крови больных синдромом Шегрена фактор, способный преципитировать экстракты ядер клеток, что послужило толчком для описания большинства разновидностей антинуклеарных антител

Непрямая иммунофлюоресценция на перевиваемой клеточной линии Нер2

Метода выявления АНФ был разработан Таном (Tan, 1982), применившим в качестве субстрата человеческую перевиваемую эпителиоидную клеточную линию HEp-2 (ATCC ref.no. CCL-23). Это клеточная линия, полученная из аденокарциномы гортани человека, представляет собой крупные полиплоидные неороговевающие плоские эпителиоциты, образующие монослой на пластике и стекле.

Рисунок: клетки клеточной линии НЕр-2, окрашенные гематологическим красителем.

Сравнительная неприхотливость этой линии, крупные ядра и присутствие всех человеческих антигенов сделало метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 основным методом обнаружения АНФ. В англоязычной литературе отсутствует единое название для этого метода, иногда этот метод для краткости обозначают как FANA(Fluorescent AntiNuclear Antibody detection). Отсутствие единства номенклатуры породило путаницу в названии лабораторных тестов. Иногда под термином «антинуклеарные антитела» иммунологические лаборатории называют тесты, как основанные на методах иммуноферментного и иммунохимическом анализе, так и метод иммунофлюоресценции. В русскоязычной литературы мы считаем необходимым сохранить отечественное название этого показателя - «антинуклеарный фактор» (АНФ), чтобы отличить иммунофлюресцентный метод от других тестов для обнаружения АНА.

Необходимо выявлять АНФ класса IgG, так как выявление АНФ, представленных другими классами иммуноглобулинов не имеет самостоятельного диагностического значения. Стандартные разведения сыворотки больного инкубируются с тканевым субстратом, что позволяет антинуклеарным антителам из сыворотки больного связаться с соответствующими ядерным мишенями. После этого места связывания аутоантител детектируются с помощью античеловеческой антисыворотки, меченной флюоресцеином.

Хотя в качестве субстратов могут применяться и другие человеческие клеточные линии, однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования именно линий Нер-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюоресценции. Ее применение улучшает чувствительность теста за счет яркой флюоресценции даже при значительных разведениях сыворотки больного, а большое, богатое эухроматином ядро позволяет точно описать тип свечения. Кроме того, применение клеточной линии Hep-2 способствует обнаружению антител Ro/SS-A, а также антител к антигенам ядрышка, которые плохо при использовании криосрезов ткани лабораторных животных. Среди других преимуществ HEp-2 можно отметить высокую частоту деления клеток, позволяющую выявлять антитела к антигенам, экспрессирующимся только при делении клетки, и отсутствие клеточного матрикса ткани, затрудняющего визуализацию специфического свечения при сравнении с гистологическими срезами.

Титры антинуклеарного фактора

Титр АНФ определяется как последнее разведение сыворотки больного, которое обладает четкой флюоресценцией ядер клеток. При использовании тканей лабораторных животных диагностический титр АНФ составляет 1:8-1:10, в то время как при использовании клеточной линии НЕр-2 рекомендуется использовать исходный титр 1:80. В этом случае в норме титры АНФ менее 1:160.

При использовании титров менее 1:160 частота слабоположительных результатов у клинически-здоровых лиц составит не более 5%, и в то же время не позволит пропустить значимые титры АНА у больных диффузными болезнями соединительной ткани.

Для определения конечного титра обычно используется титрование шагом х2 (1:160-1:320 - 1:640 - 1:1280 - 1:2560 - 1:5120 и т.д. Может использоваться и более грубое титрование. На фоне обострения ревматических заболевания обычно отмечаются титры АНФ более 1:640, а при ремиссии титры снижаются до 1:160-1:320.

Существуют рекомендации по бальной оценке результатов выявления АНФ, указыващей содержание «в крестах». Это позволяет лабораториям экономить реактивы и уменьшить трудозатраты на выполение исследований. В этом случае определение конечного титра не представляется возможным. Необходимо учитывать, что конечный титр имеет более важное значение, по сравнению с количеством связавшихся с субстратом аутоантител, так как непосредственно связан с аффинностью их взаимодействия с антигеном. Желательно определять конечный титр у всех положительных больных, что позволяет уточнять присутствие в сыворотке высокоаффинных аутоантител, которые более тесно связаны с активностью процесса.

Тип свечения ядра антинуклеарного фактора

Уже в первом опыте клинического применения непрямой иммунофлюоресценции для выявления АНФ с использованием криосрезов тканей лабораторных было отмечено, что сыворотка больных с аутоиммунными заболеваниями заболеваниями по разному «окрашивала» ядра клеток, что приводило к селективному свечению некоторых структур ядра. Уточнение этого феномена привел к описанию так называемых «типов свечения» ядра в иммунофлюоресцентном тесте. Это связано с тем, что каждая разновидность АНА имеет конкретные клеточные мишени, вследствие чего тип свечения ядра, ядрышка и цитоплазмы клетки отражает взаимодействие АНА сыворотки больного с антиген-содержащими структурами внутри клетки. Тип свечения зависит от присутствия конкретных аутоантител в сыворотке крови больного, на основе чего, можно сделать предварительное заключение относительно тех разновидностей АНА, которые имеются в данной сыворотке. Однако применение гистологических срезов тканей лабораторных животных не позволяет достоверно установить тип свечения. В то же время использование перевиваемых клеточных линий, таких как Нер-2 позволяет описать значительное количество вариантов окрашивания ядра и цитоплазмы. Существует три основные группы антигенов, присутствие антител к которым определяет различные типы свечения:

Тип свечения ядра клетки значительно увеличивает информативность выявления АНФ, в связи с чем, должен рутинно определяться при определении этого показателя. Использование клеток линии НЕр-2 позволяет охарактеризовать более 20 различных вариантов окрашивания ядра, которые зависят от спектра АНА, присутствующих в исследуемой сыворотке. Однако для практической лаборатории достаточно различать 6 основных вариантов свызывания аутоантител с антиген-содержащими структурами клетки.

Выделяют гомогенный, периферический, гранулярный (мелко-/крупно-), ядрышковый, центромерный и цитоплазматический типы свечения ядра. Каждому типу свечения присущи очень характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого, а также набор антигенам, с которыми реагируют аутоантитела в сыворотках больных. Описание типов свечения представляет ценную клиническую информацию само по себе, кроме того, тип свечения может указывать на необходимость проведения определенных лабораторных тестов в дальнейшем.

При гомогенном типе свечения аутоантитела реагируют с теми антигенами, которые распределены в ядре диффузно, т.е. входят в состав хроматина. Характерно, при обнаружении гомогенного типа свечения, в делящихся клетках ярко окрашиваются конденсированные хромосомы. Основными структурными единицами хроматина являются нуклеосомы - комплексы ДНК и гистонов. Таким образом, гомогенный тип свечения предполагает наличие антител против нуклеросом, дсДНК и антител к гистонам. Он встречается у больных с СКВ и лекарственной волчанкой, а также у больных со склеродермией. Обычно обнаружение высокого титра АНФ с гомогенным типом свечения указывает на диагноз СКВ.

Периферический тип свечения часто выделяют отдельно, хотя он является разновидностью гомогенного типа свечения. Его выявление является артефактом фиксации клеток, что приводит к перераспределению хроматина в ядре на периферию. Важно отличать периферический тип свечения от окрашивания ядерной мембраны, которое отмечается при аутоиммунных заболеваниях печени. Периферический тип свечения обнаруживается у больных с антителами к двуспиральной ДНК и выявляется преимущественно у больных с СКВ.

Гранулярный тип является наиболее частым встречающимся и, одновременно, наиболее неспецифическим. Иногда этот тип свечения в отечественной литературе называют «крапчатым» или «сетчатым». Название «гранулярный» более точно отражает этот феномен, так как в этом случае аутоантитела реагируют с гранулами в ядре, представляющими надмолекулярные нуклеопротеиновые комплексы. Такие комплексы белков и нуклеиновых кислот осуществляют в ядре ряд функций, необходимых для нормального функционирования клетки. К таким комплексам, в частности, относятся сплайсосомы, которые осуществляют посттранскрипционную перестройку мРНК, необходимую для синтеза белка на рибосомах. В составе присутствут множество различных нуклеопротеинов, что обуславливает многообразие антигенных мишеней при обнаружении гранулярного типа свечения. К основным аутоантигенам, антитела к которым приводят к визуализации гранулярного типа свечения, относят Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигены и PCNA. Клетки в процесс деления утрачивают большинство сформированных нуклеопротеиновых комплексов, поэтому митотические фигуры в клеточной линии при гранулярном типе свечения не окрашиваются. Гранулярный тип свечения ядра отмечается у больных при СКВ, СШ, СС, ДМ/ПМ, РА и ряда других аутоиммунных заболеваниях. Низкие титры АНФ с гранулярным типом преобладает в сыворотках крови у клинически здоровых лиц с АНФ без признаков системного заболевания.

Выявления очень высоких титров АНФ (1:2560-1:10000) с крупногранулярным типом свечения ядра обычно указывает на диагноз смешанного заболевания соединительной ткани и требует дообследования для выявления RNPантигена, который является основным серологическим маркером этого заболевания.

Антигены ядрышка могут выступать в качестве мишеней АНА, что приводит к обнаружению ядрышкового типа флюоресценции. Выявление ядрышкового типа свечения характерно для склеродермии и ее разновидностей. Ядрышковый тип флюоресценции определяется у больных при наличии антител к компонентам ядрышка, таким как PHК полимераза 1, NOR, U 3 RNP, PM/Scl.

Центромерный тип флюоресценции отмечается при появлении антител к центромерам хромосом, и обнаруживается только в делящихся клетках. Его присутствие характерно при CREST варианте склеродермии.

Цитоплазматический тип свечения указывает на антитела к тРНК-синтетазам, в частности Jo-1, которые отмечаются при полимиозите. Кроме того, он выявляется у больных с АНА, направленными против других компонентов цитоплазмы клетки: антитела к актину при аутоиммунном гепатите, антитела к митохондриям при первичном билиарном циррозе.

Можно охарактеризовать ряд других разновидностей свечения, причем эти типы окрашивания ядра клеток могут быть характерны для конкретной разновидности АНА. Так антитела к Scl-70 в иммунофлюоресцентном тесте на HEp-20 клетках дают мелкогранулярное окрашивание ядра и ядрышек, анти-р80 - светящиеся точки в ядре, которые отсутствуют в митотических клетках. Однако необходимо указать на редкость и разнообразие таких феноменов, что делает излишним их выявление при рутинных исследованиях.

Нередко может встречаться сочетание нескольких типов свечения, например мелкогранулярного и ядрышкового, что характерно для антител к Scl-70. Более того, часто в низких разведениях преобладает один тип свечения, например гранулярный, а при дальнейших разведениях выявляется гомогенный или центромерный типы флюоресценции, что свидетельствует о наличии в сыворотке больного различных видов АНА. Хотя тип свечения дает врачу определенные данные в пользу того или иного диагноза, необходимо принимать во внимание сравнительно низкую его специфичность и разнообразие встречающихся феноменов, что требует дальнейшего лабораторного обследования.

Обнаружение АНФ является основой для использования других лабораторных тестов, уточняющих спектр АНА в крови больных. Учитывая крайнюю информативность этого теста, дальнейшее тестирование и анализ результатов последущего обследования должен интерпретироваться в зависимости от результатов оценки типа свечения и титра АНФ.

Хотя отсутствие значимых титров АНФ практически всегда исключает диагноз активного системного ревматического заболевания, но при использовании клеточной линии НЕр-2, у 2-4% больных, удовлетворяющих критериям для диагноза СКВ, АНА не определяются или титры низки. Этих больных иногда относят к группе «АНФ-негативной СКВ », для уточнения диагноза у таких больных требуется дальнейшее обследование, прежде всего выявление антител к SS-Aантигенам. Эти антигены обладают хорошей растворимостью и могут утрачиваться из ядер клеток. Для сокращения этой категории пациентов используется комплексное тестирование, включающее определение антител к экстрагируемым ядерным антигенам, так называемый «скрининг заболеваний соединительной ткани », тест 000723 . Отрицательный результат такого обследования позволяет с очень высокой вероятностью позволяет исключить диагноз СКВ и других системных ревматических заболевании.

Иммунная система человека – уникальный слаженный механизм, способный реагировать на любые внешние внедрения патогенных факторов, тем самым защищая организм от целого ряда заболеваний. Но как известно, из каждого правила есть исключения, и в данном случае они выглядят как реагирование иммунитета на собственные клетки, что получило название аутоиммунные болезни.

При данных патологиях идет выработка антител, атакующих здоровые клетки, поражая или уничтожая их. В результате происходит нарушение функционирования отдельных тканевых структур и даже органов. Такие патологии из-за своей распространенности и вовлеченности в процесс нескольких органов или систем получили название системных заболеваний.

При появлении современных методов лабораторной диагностики, одним из которых является АНФ анализ крови на поиск антинуклеарного фактора, позволяющий выявить антинуклеарные (антиядерные) антитела и определить причину патологии. Данный показатель является одним из маркеров системных заболеваний соединительной ткани (СЗСТ), принятым как «золотой стандарт» данного вида исследований.

Основные понятия, характеризующие СЗСТ

Как уже описывалось выше, патогенез данных патологий берет свое начало со сбоев функционала иммунной системы, и выработке защитных антител к определенным компонентам собственных клеток. Такие клетки за особенность своего происхождения имеют второе название – аутоантитела. В процессе иммунного сбоя они вступают в контакт с белковыми соединениями ядра, нуклеиновыми кислотами и антигенами цитоплазмы, что приводит к появлению симптомов воспалительных заболеваний, таких как:

• структурные изменения тканей и органов;
• выраженное необоснованное утомление;
• болевые ощущения в мышцах и суставах;
• поражение кожных покровов;
• снижение веса тела и другие.

Антинуклеарные антитела (АНА) могут образовываться при довольно обширном спектре аутоиммунных патологий, но наибольшая вероятность их появления при системной красной волчанке (СКВ).

АНФ необходимо сдать при признаках длительного воспалительного процесса

Справка! По статистике, более чем у 90% пациентов, страдающих СЗСТ, определяется патологическая выработка подобных антител. На текущий момент изучено около 200 их видов, которые получили обобщенное название – антинуклеарный фактор. В основном они представлены иммуноглобулинами класса G, но иногда встречаются М или А.

Суть анализа крови на антинуклеарный фактор

Прежде чем углубляться в особенности проведения исследования на АНФ, стоит отметить, что методика была изобретена и начала применяться довольно давно – в 60-х годах прошлого века. Но широкое распространение в диагностической практике получила лишь в начале 80-х годов XX века после усовершенствования. В качестве субстрата еще в 1961 году ученый Beck применял клетки лабораторных животных, и только в 1982 году Tan воспользовался перевиваемой клеточной линией человека HEp-2 для поиска АНФ.

Хотя основная цель использования данного теста – это установление диагноза красная волчанка, все же он считается универсальной методикой и для других коллагенозов (СЗСТ). К последним относятся:

• склеродермия;
• дерматомиозит;
• узелковый периартериит;
• хронический активный гепатит и т. д.

Одной из наиболее удобных, и поэтому чаще всего используемых методик для определения в крови пациентов антинуклеарного фактора, считается непрямая иммунофлюорестенция. Исследование проводится при нанесении сыворотки крови на клетки перевиваемой эпителиоидной линии аденокарциномы гортани человека НЕр-2 (содержащих определенный ряд ядерных антигенов) с применением меченого коньюгата (соединения) с антителами.

Этот выбор сделан неслучайно – клетки НЕр-2 – очень удобный субстрат для изучения биоматериала. Они имеют довольно крупные ядра, и при высадке на лабораторных стеклах растут однослойно. В качестве субстрата можно использовать и другие клеточные линии человека, но удачная морфология и культивирование однозначно делает именно НЕр-2 – незаменимым материалом.

В ходе диагностики при инкубации сыворотки обследуемого с клеточным субстратом, при наличии АНА происходит их соединение с соответствующими нуклеарными антигенами. Места связки АНФ с НЕр-2 определяются при использовании меченого флюоресцеином (красителем) коньюгата. Для выполнения оценки результатов произошедших реакций применяется люминесцентный микроскоп, позволяющий дифференцировать характер и степень получившихся связок.

Люминесцентный микроскоп для лабораторных исследований АНФ

Справка! HEp-2 человека, в отличие от тканевых криосрезов животных, имеют более высокую скорость деления клеток, что дает возможность обнаружить антитела к антигенам, которые экспрессируются лишь при делении. Также в субстрате человека отсутствует клеточный матрикс, снижающий качество визуализации изучаемого свечения.

Какие группы антигенов используются при исследовании?

При расшифровке материалов всегда необходимо брать во внимание, что в спектр АНА входит довольно большая группа аутоантител к нуклеопротеидам, рибонуклеопротеидам, гистонам, ДНК и другим структурным единицам ядра. Из этого следует, что функционал теста направлен на выявление антител к составляющим ядра и цитоплазмы, которые изначально были определены при СКВ.

Позже диагностические возможности исследования были расширены, что обусловлено определением подобных антител при других СЗСТ. В скрининговых методиках для обнаружения суммарных АНА, как правило, применяется определенный набор антигенов, принятых за основные маркеры аутоиммунных ЗСТ.

К ним относятся антитела класса IgG:

• SS-A (Ro) – ядерные рибонуклеопротеины;
• SS-B (La) – ядерные белки;
• Scl-70 – белок-фермент (топоизомераза-1);
• нативная двухцепочная ДНК;
• RNP/Sm – комплекс антигенов;
• Jo-1 – фермент РНК – синтетаза;
• CENP-B (центромера)
• Hep-2 клетки;
• митохондрии (PDC).

АНА практически безвредны для организма – они не способны проникать в живые ткани. Но в отдельных случаях могут соединяться в комплексы антиген-антитело, что в результате приводит к структурным разрушениям тканей. Одним из таких примеров является поражение паренхимы почек при СКВ. Так как при СЗСТ в процесс вовлечено несколько органов, то выявление АНА не является первостепенно важным для диагностики, а считается лишь подтверждением определенной симптоматики.

Возможности анализа АНФ, выраженные в процентном соотношении

Изучение полученных результатов

После проведения всех необходимых процедур – взятия биоматериала и его лабораторной подготовке к исследованию, проводится оценка и интерпретация результатов. Сюда входит определение титра (концентрации) антител и типа свечения. Значимым параметром для диагностики является показатель концентрации свыше 1:160. К примеру, при обострении ревматизма он может превышать отметку 1:640, тогда как в ремиссионном периоде наблюдается понижение до 1:160–1:320.

Тип свечения показывает мишени АНА, что является особо важным клиническим моментом, направляющим последующие действия врача в назначении диагностических мероприятий. По характеру свечения ядер при использовании НЕр-2 определится свыше 20 вариантов ядерного окрашивания, в зависимости от видов присутствующих антител в биоматериале. К основным из них относятся следующие типы свечения.

• Периферическое. Свечение свидетельствует о наличии анти-ДНК-антител, что подтверждает СКВ. Основным видом антигенов для периферического типа являются гистоновые белки и ДНК.
• Диффузное (гомогенное). Такое свечение наблюдается при СКВ, сопровождающейся поражением структуры почек и похожих ЗСТ, нефрите, склеродермии, а также лекарственно-индуцированной СКВ. Антигены при данном типе представлены дсДНК, гистонатами и нуклеосомами.
• Ядрышковое (нуклеарное). Данный тип характерен для системной формы склеродермии, и определяется при присутствии у пациентов антител – PHК полимераза 1, PM/Scl, NOR, U3RNP.
• Цитоплазматическое. Подобный тип подсвечивания указывает на наличие АНА к тРНК–синтетазам, а именно Jo-1, и наблюдается при полимиозите.
• Гранулярное. Определяется при синдроме Шегрена, инфекционном мононуклеозе, смешанном ЗСТ (Sharp-синдром, MCTD) и лекарственном волчаночном синдроме. Преимущественно присутствующие антигены для этого типа – SS-A, SS-B, Sm, U1-RNP, и PCNA.
• Крупногранулярное. Характерно для смешанных ЗСТ и, по мнению многих ученых, связано с наличием антигена RNP.
• Мелкогранулярное. Определяется присутствие антител, образующихся против рибонуклеиновых белков – АSSP (АЦЦП), SS-A, SS-B и других. Такие антитела характерны для СКВ, также ее специфических кожных формах, ревматоидном артрите, склеродермии, полимиозите, синдроме Шегрена.
• Центромерное. Данный тип в основном отмечается при склеродермии. Хотя в одном образце крови, особенно у обследуемых с диффузными ЗСТ, в отделенной плазме могут определяться антитела к различным ядерным компонентам.
• Точечные вкрапления в ядре. Этот тип преимущественно выявляется при болезнях печени аутоиммунного характера. При нем могут сочетаться несколько флюоресцентных типов, к примеру, ядрышковый и мелкогранулярный, что обусловлено антителами к Scl-70.

Справка! Отмечено, что при увеличении разведения плазменного биоматериала параметры свечения могут видоизменяться, так как для многих антител характерна смена активности при разной степени концентрации.

Факторы, способные исказить результаты

На достоверность полученных в ходе исследования данных могут повлиять всего несколько факторов, способных показать и ложноположительный и ложноотрицательный результат. Так, неправдоподобные ответы со сдвигом вверх наблюдаются у пожилых пациентов в возрасте от 60 лет (по статистике в 10–37% случаях) и при приеме медпрепаратов, вызывающих лекарственную волчанку (некоторые антибиотики, контрацептивы, сульфаниламиды, тиазидные диуретики).

Отмечено, что у 5–55% особ женского пола, имеющих грудные имплантаты, повышается уровень концентрации АНА. К ошибочной диагностике со сдвигом вниз может привести употребление глюкокортикоидных препаратов – Преднизолона, Метипреда или Дексаметазона.

Существует ряд заболеваний, при которых защитная система принимает клетки собственного организма за чужеродные, после чего начинает ошибочно их атаковать. Большинство аутоиммунных патологий имеют хроническую форму и представляют серьезную угрозу для здоровья. Для того чтобы выявить данные недуги на самой ранней стадии их развития, врачи назначают анализ АНФ. Данная аббревиатура расшифровывается как «антинуклеарный фактор». В некоторых заключениях исследование помечается как АНА. Значение расшифровывается как «анализ на антинуклеарные антитела». АНФ - это клинически значимый показатель, помогающий врачу составить максимально эффективную схему лечения и не допустить развития осложнений.

Суть метода

Биологическим материалом для исследования является кровь. При проникновении в организм любого патогенного микроорганизма иммунная система начинает вырабатывать специфические антитела, задачей которых является уничтожение чужеродных антигенов. Суть метода и заключается в обнаружении и количественном определении этих веществ в жидкой соединительной ткани.

Врачи утверждают, что АНФ-анализ крови - это лабораторный имеющий высокую степень информативности. С его помощью возможно выявить любые аутоиммунные патологии даже на ранней стадии их развития.

Специфические антитела также нередко выявляются у людей, страдающих от тяжелой формы гепатита, онкологии и некоторых инфекционных заболеваний. Данные вещества могут быть обнаружены и у здоровых людей. Подобная ситуация требует комплексного подхода для выявления причины.

АНФ-анализ иногда подразумевает оценку количественного содержания иммуноглобулинов. Их наличие может свидетельствовать о развитии коллагенозов и заболеваний ревматического характера.

Показания

Важно знать, что АНФ-анализ крови - это исследование, которое назначается с целью подтверждения или исключения наличия аутоиммунных патологий, а также для оценки эффективности проведенного лечения.

Заподозрить недуг врач может по следующим симптомам:

• Длительно сохраняющееся состояние лихорадки без явных причин.
• Болезненные ощущения в суставах.
• Повышенная степень утомляемости.
• Ломота в мышцах и суставах.
• Кожные проявления без явных причин.
• Частые эпизоды мышечных судорог.
• Повышенная температура тела.
• Уменьшение массы тела.
• Регулярные эпизоды тошноты.
• Головная боль.
• Нарушение слуха.
• Диарея.

Кроме того, АНФ-анализ назначается при подозрении на наличие ревматического заболевания. Исследование проводится после получения результатов лабораторной диагностики, в которых увеличены показатели СОЭ, ЦИК и С-реактивного белка.

Что показывает

АНФ-анализ крови позволяет выявить патологии аутоиммунного характера. Исследование информативно в отношении следующих заболеваний:

• Системной красной волчанки.
• Острого рассеянного энцефаломиелита.
• Болезни Шегрена.
• Ревматоидного артрита.
• Очаговой алопеции.
• Болезни Аддисона.
• Анкилозирующего спондилита.
• Антифосфолипидного синдрома.
• Аутоиммунной гемолитической анемии.
• Буллезного пемфигоида.
• Аутоиммунного гепатита.
• Глютеновой болезни.
• Аутоиммунных патологий внутреннего уха.
• Болезни Чагаса.
• Синдрома Черджа-Стросса.
• Хронической обструктивной болезни легких.
• Дерматомиозита.
• Болезни Крона.
• Сахарного диабета I типа.
• Синдрома Гудпасчера.
• Тиреоидита Хашимото.
• Базедовой болезни.
• Синдрома Гийена-Барре.
• Болезни Кавасаки.
• Гнойного гидраденита.
• Первичной нефропатии.
• Идиопатической тромбоцитопенической пурпуры.
• Интерстициального цистита.
• Эритематозной волчанки.
• Синдрома Шарпа.
• Кольцевидной склеродермии.
• Рассеянного склероза.
• Нарколепсии.
• Нейромиотонии.
• Обыкновенной пузырчатки.
• Псориаза.
• Феномена Рейно.
• Васкулита.
• Гранулематоза Вегенера.

Это неполный список заболеваний. Важно, что анализ АНФ показывает развитие аутоиммунных патологий на самой ранней стадии их течения. Это позволяет врачу определиться с тактикой лечения, а в дальнейшем оценить его эффективность.

Подготовка

Забор биоматериала осуществляется в утренние часы. Сдавать кровь необходимо натощак. Последний прием пищи должен быть совершен минимум за 4 часа. При этом пить воду допустимо в любое время и в любых количествах. Под запретом употребление алкоголя.

За 1 день до исследования показан покой. Физические и психоэмоциональные нагрузки нередко приводят к ложному результату. За полчаса до сдачи крови запрещено курить.

Необходимо поставить в известность врача о принимаемых медикаментах во время назначения им анализа АНФ. Это обусловлено тем, что активные компоненты некоторых препаратов провоцируют выработку антител и также могут стать причиной лекарственной волчанки. Ложноотрицательные результаты нередко являются следствием приема глюкокортикостероидов.

Если пациенту были назначены физиопроцедуры или инструментальные обследования, их необходимо проводить только после сдачи крови.

Забор биоматериала

Он осуществляется в утренние часы. Биологическим материалом является венозная кровь. Ее забор проводится согласно стандартному алгоритму. Как правило, кровь берется из вены, расположенной на локтевом сгибе.

После того как жидкая соединительная ткань будет получена, из нее выделят сыворотку. Именно она необходима для проведения анализа.

Виды исследований и их описание

В настоящее время обнаружить антитела в биоматериале возможно несколькими способами:

1. С помощью непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии. Если специфические вещества присутствуют в крови, они начнут связываться с особыми ядерными антигенами. В лабораториях используются элементы, которые способны светиться в отдельном спектре. Затем биоматериал тщательно изучается под микроскопом. Заболевание можно заподозрить по типу свечения. Данный способ признан самым информативным в отношении определения значения антинуклеарных антител. Одной из разновидности методики является исследование с использованием клеток НЕр. Анализ АНФ в этом случае подразумевает забор биоматериала и с гортани. Процесс не сопряжен с возникновением болезненных и иных дискомфортных ощущений. Важно знать, что анализ крови АНФ НЕр-2 - это в настоящее время самое точное исследование. Эпителиальные клетки с гортани инкубируют с сывороткой, после чего их также соединяют с флуоресцентными веществами.
2. С помощью Его суть заключается в том, что когда происходит взаимосвязь антител и антигенов, цвет раствора меняется. Наличие того или иного оттенка позволяет заподозрить наличие определенной патологии.

Расшифровкой АНФ-анализа должен заниматься лечащий врач. При наличии положительных результатов исследований назначаются дополнительные тесты. Окончательный диагноз не ставится на основании заключения одного анализа.

Нормальные значения

Наилучшим результатом является тот, при котором антинуклеарные антитела отсутствуют. Однако стоит помнить о том, что они могут обнаружиться и у совершенно здоровых людей. В этом случае показано проведение повторного исследования.

Норма анализа АНФ - титр не более 1:160. При этом данный показатель актуален как для взрослых, так и для детей.

Во время расшифровки АНФ-анализа крови важно учитывать следующую информацию:

• Низкие титры не являются гарантией того, что патологии аутоиммунного характера нет. Согласно статистике, у 5% пациентов с результаты исследования отрицательные.
• Если у человека налицо все симптомы аутоиммунного заболевания, а анализ при этом свидетельствует об обратном, врач не исключает наличие недуга. В подобных ситуациях дополнительно проводится иммуноферментное исследование.

Анализ АНФ, осуществленный с помощью клеток НЕр-2, считается нормальным, если титр не выше 1:160. Результат более 1:640 свидетельствует об обострении ревматических патологий. В период ремиссии заболевания титр снижается до 1:320. При этом только врач сможет выявить тот факт, о чем говорит такой низкий показатель, основываясь на данных анамнеза и индивидуальных особенностях здоровья пациента.

АНФ повышен

Связываясь с антигенами, образуют иммунный комплекс. Последний, в свою очередь, является пусковым фактором развития воспалительного процесса в стенках сосудов. В результате у человека появляются первые тревожные симптомы системных заболеваний. Анализ же показывает высокие титры.

В этом случае патологию можно выявить, определив тип свечения. Интерпретация результатов:

• Гомогенное. Подобное свечение может свидетельствовать о наличии системной красной волчанки, хроническом гепатите и склеродермии.
• Периферическое. Всегда говорит о развитии
• Гранулярное. Возможные заболевания: синдром Шегрена, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, смешанная патология соединительной ткани.
• Ядрышковое. Данный тип свечения характерен для системной красной волчанки, полимиозита, синдрома Шегрена и склеродермии.
• Центромерное. Возможные патологии: кальциноз кожи, эзофагеальная дисфункция, синдром Рейно, телеангиэктазия, склеродактилия.
• Цитоплазматическое. Подобное свечение говорит об аутоиммунных заболеваниях печени или о полимиозите.

АНФ понижен

Уменьшение уровня антинуклеарных антител имеет клинически важное значение исключительно при прогнозировании и мониторинге имеющихся и ранее выявленных системных заболеваний.

Показатель АНФ напрямую зависит от интенсивности патологического процесса. В связи с этим его уменьшение - это благоприятный признак, свидетельствующий о том, что лечение было проведено успешно, а болезнь перешла в стадию ремиссии.

Лечение

Каждая патология аутоиммунного характера требует определенного терапевтического подхода. Цель проведения исследования крови на АНФ - выявить в жидкой соединительной ткани антитела и оценить характер их взаимодействия со специфическими антигенами. На основании результатов диагностики врач может предварительно поставить диагноз. Для его подтверждения необходимо проведение дополнительных исследований. И только после этого врачом составляется схема лечения. Выбор медикаментозных средств напрямую зависит от того, какая патология выявлена у человека.

Стоимость

Сдать анализ АНФ можно в независимой лаборатории, частной клинике или государственном медицинском учреждении. Важно знать о том, что не во всех бюджетных поликлиниках подобная услуга предоставляется. Относительно ее наличия необходимо уточнять в регистратуре.

Исследование является платным даже в государственных медицинских учреждениях. Стоимость анализа напрямую зависит от ценовой политики клиники, складывающейся из множества факторов. Минимальная цена составляет 1000 рублей, максимальная не превышает 1700 рублей. Кроме того, необходимо дополнительно оплатить забор крови. Стоимость данной услуги, как правило, не превышает 200 рублей.

В заключение

Аббревиатура АНФ расшифровывается как антинуклеарный фактор. В норме он не должен присутствовать в крови здорового человека или же его концентрация должна быть менее 1:160. Анализ на АНФ назначается для того, чтобы выявить у пациента патологии аутоиммунного характера на самой ранней стадии их развития.

Суть метода: при проникновении в организм провоцирующих агентов защитной системой начинают вырабатываться антитела. Их задача - атаковать антигены и уничтожить их. Для выявления данной реакции у пациента осуществляется забор венозной крови с последующим отделением сыворотки. В последнюю добавляют специфические антигены и оценивают дальнейшие реакции.